藥用植物代謝組學(xué)的研究進(jìn)展

　　這是一篇藥用植物代謝組學(xué)的內(nèi)容，代謝組學(xué)正日益成為研究的熱點(diǎn)，越來越多的人已加入到代謝組學(xué)的研究中。隨著代謝組學(xué)積累的數(shù)據(jù)和信息量的增大，其在藥用植物學(xué)各個(gè)領(lǐng)域的應(yīng)用價(jià)值也與日俱增。

　　【摘要】 從技術(shù)步驟、剖析辦法以及實(shí)踐使用三個(gè)方面對以后藥用動(dòng)物代謝組學(xué)研討范疇的一些實(shí)際成績和理論中面臨的應(yīng)戰(zhàn)停止綜述。

　　【關(guān)鍵詞】 藥用動(dòng)物;代謝組學(xué);功用基因組學(xué)

　　代謝組學(xué)是對生物體內(nèi)代謝物停止大規(guī)模剖析的一項(xiàng)技術(shù)[1]，它是零碎生物學(xué)的重要組成局部(如圖1所示)，藥用動(dòng)物代謝組學(xué)次要研討外界要素變化對動(dòng)物所形成的影響，如氣候變化、養(yǎng)分脅迫、生物脅迫，以及基因的漸變和重組等惹起的巨大變化，是物種表型剖析最強(qiáng)無力的工具之一。在古代中藥研討中，代謝組學(xué)在藥物無效性和平安性、中藥資源和質(zhì)量控制研討等方面具有重要實(shí)際意義和使用價(jià)值。另外，在對形式動(dòng)物漸變體文庫或轉(zhuǎn)基因文庫停止剖析之前，代謝組學(xué)往往是首先思索采用的研討辦法之一。目前，國外已有成功應(yīng)用代謝組學(xué)技術(shù)對擬南芥漸變株停止大規(guī)�；�因挑選的例子，這爲(wèi)與重要性狀相關(guān)基因功用的說明和選育可供商業(yè)化應(yīng)用的轉(zhuǎn)基因作物奠定了根底。

　　目前，還有許多經(jīng)濟(jì)作物的全基因組測序方案尚未完成，由于代謝組學(xué)研討并不要求對基因組信息的理解，所以在與這些作物有關(guān)的研討范疇具有更大的應(yīng)用價(jià)值，這也是其與轉(zhuǎn)錄組學(xué)和蛋白組學(xué)研討相比的劣勢之一。代謝組學(xué)研討觸及與生物技術(shù)、剖析化學(xué)、無機(jī)化學(xué)、化學(xué)計(jì)量學(xué)和信息學(xué)相關(guān)的少量知識，F(xiàn)iehn[2]對代謝組學(xué)有關(guān)的研討方向停止了分類(見表1)。

　　一、代謝組學(xué)研討的技術(shù)步驟

　　代謝組學(xué)研討觸及的技術(shù)步驟次要包括動(dòng)物栽培、樣本制備、衍生化、別離純化和數(shù)據(jù)剖析5個(gè)方面(見圖2)。

　　1.1動(dòng)物栽培

　　對研討對象停止培育的目的是爲(wèi)了對樣本的波動(dòng)性停止控制，絕對于微生物和植物而言，動(dòng)物的人工栽培需求考

　　慮更多的成績，如中藥材在不同年齡、不同發(fā)育階段、不同部位以及光照、水肥、耕作等環(huán)境要素的巨大差別都可惹起生理形態(tài)的變化，而這些非可控及可控雙重要素的影響很難停止準(zhǔn)確的控制，從而影響藥用動(dòng)物代謝組研討的反復(fù)性。爲(wèi)理解決以上成績，引薦運(yùn)用大容量的培育箱[3]，定時(shí)改換培育箱中栽培對象的地位，以及運(yùn)用無土栽培技術(shù)等，F(xiàn)ukusaki E[4]應(yīng)用無土栽培零碎將水和營養(yǎng)間接引入動(dòng)物根部，并且對供應(yīng)量停止準(zhǔn)確地控制，大大進(jìn)步了實(shí)驗(yàn)的反復(fù)性。

　　1.2樣本制備

　　爲(wèi)了取得波動(dòng)的實(shí)驗(yàn)后果，樣本制備需求思索樣本的生長、取樣的工夫和地點(diǎn)、取樣量以及樣本的處置辦法等成績，并依據(jù)剖析對象的分子構(gòu)造、溶解性、極性等理化性質(zhì)及其絕對含量大小對提取和別離的辦法停止選擇，逐一優(yōu)化實(shí)驗(yàn)方案。Maharjan RP等[5]用6種辦法辨別對大腸桿菌中代謝產(chǎn)物停止提取，發(fā)現(xiàn)用-40℃甲醇停止提取的效果最好�，F(xiàn)階段代謝組學(xué)的剖析對象次要集中在親水性小分子，尤其是初級代謝產(chǎn)物，氣相色譜?質(zhì)譜聯(lián)用(GC?MS)和毛細(xì)管電泳?質(zhì)譜(CE?MS)聯(lián)用都是剖析親水小分子的重要技術(shù)。Fiehn O等[6]運(yùn)用GC?MS對擬南芥葉片中的親水小分子停止了剖析，發(fā)現(xiàn)酒石酸半縮醛、檸蘋酸、別蘇氨酸、羥基乙酸等15種動(dòng)物代謝物。

　　1.3衍生化處置

　　對目的代謝產(chǎn)物的衍生化處置取決于所運(yùn)用的剖析設(shè)備，GC?MS零碎只合適對揮發(fā)性成分停止剖析，高效液相色譜法(HPLC)普通則運(yùn)用紫外或熒光標(biāo)志的辦法對樣本停止衍生處置，Blau K[7]對酯化、�；�、烷基化、硅烷化、硼烷化、環(huán)化和離子化等衍生辦法停止了詳細(xì)的闡明。但是離子化抑制常使得質(zhì)譜剖析進(jìn)程中目的代謝產(chǎn)物的離子化效率降低，這次要是由于別離進(jìn)程中凈化物與目的代謝物難以完全別離開所惹起的，優(yōu)化色譜別離工夫可無效緩解離子化抑制，但是在實(shí)踐操作中不能夠?qū)ι习俜N代謝產(chǎn)物的別離工夫停止優(yōu)化，應(yīng)用非放射性同位素濃縮法停止絕對定量可以很好的處理該成績。Han DK等[8]使用同位素編碼的親和標(biāo)志(ICAT)，依據(jù)經(jīng)誘導(dǎo)分化的微粒蛋白及其同位素標(biāo)志物的峰面積比，對該蛋白的絕對含量停止剖析。Zhang R等[9]發(fā)現(xiàn)同位素標(biāo)志技術(shù)也可用于代謝組學(xué)的研討，但是卻存在許多困難�；铙w的同位素標(biāo)志辦法關(guān)于同位素的洗脫是一種十分有潛力的技術(shù)，目前關(guān)于運(yùn)用34 s的研討已有報(bào)道[10]。

　　1.4別離和定量

　　別離是代謝組學(xué)研討中的重要步驟，與質(zhì)譜聯(lián)用的色譜和電泳剖析技術(shù)都是運(yùn)用紫外或電化學(xué)檢測的辦法停止定量，其對代謝組數(shù)據(jù)的分辨率與定量才能都有一定的影響。Tomita M等[11]總結(jié)了各種色譜別離法中常常遇到的技術(shù)成績，以為毛細(xì)管電泳和氣相色譜法由于具有較高的分辨率，已成爲(wèi)代謝組學(xué)研討的慣例技術(shù)手腕之一，液相色譜因其適用范圍廣，使用也相當(dāng)普遍。

　　Tanaka N等[12]用高效液相色譜對樣品停止別離，以為運(yùn)用硅膠基質(zhì)填充毛細(xì)管全體柱的高效液相色譜零碎具有用量少、靈敏性高、高壓降高速別離等劣勢;同時(shí)，Tolstikov V等[13]也運(yùn)用硅膠填充的毛細(xì)管液相色譜辦法對聚戊烯醇類異構(gòu)體停止了無效別離，取得了很好的分辨率。Tanaka N等[14]發(fā)現(xiàn)二維毛細(xì)管液相色譜法的分辨率比傳統(tǒng)的高效液相法高10倍。絕對于其他色譜辦法而言，超臨界流體色譜(SFC)是別離疏水代謝物最具潛力的技術(shù)之一，特別適用于別離那些傳統(tǒng)HPLC難以剖析的疏水聚合物，Bamba T等[15]經(jīng)過SFC對聚戊烯醇停止剖析，證明其具有較好的別離才能。針對質(zhì)譜中存在的共洗脫景象，Halket JM等[16]創(chuàng)造了一種適用于GC?MS的反褶積零碎，對共洗脫的代謝產(chǎn)物停止別離與辨認(rèn)。Aharoni A等[17]運(yùn)用傅立葉變換離子盤旋共振質(zhì)譜(FT?ICR?MS)對非目的代謝物停止剖析，疾速掃描動(dòng)物漸變樣品，取得了一定量的代謝成分。

　　與別離一樣，定量才能也是代謝組學(xué)研討中的重要要素，其取決于各剖析零碎的線性范圍。傅立葉轉(zhuǎn)換核磁共振(FT?NMR)、傅立葉紅外光譜(FT?IR)以及近場紅外光譜法(NIR)等技術(shù)由于敏理性低，反復(fù)性受共洗脫景象影響較小也被用于檢測中。近年來，F(xiàn)T?NMR技術(shù)常被用于動(dòng)物代謝組的指紋圖譜研討 [18]，但由于NMR剖析需求樣品量較大，剖析后果易受凈化，Griffin J L [19]發(fā)現(xiàn)將統(tǒng)計(jì)形式辨認(rèn)與FT?NMR相結(jié)合可以對代謝物停止片面剖析。除FT?NMR之外，F(xiàn)T?IR經(jīng)過對無機(jī)成分的構(gòu)造停止慣例光譜測定，也可適用于代謝組學(xué)的研討，特別是使用于構(gòu)建代謝組學(xué)的指紋圖譜。雖然它不能對代謝物停止片面剖析，但對具有特定功用的組分卻有很好的定量效果，對從工業(yè)及食品原資料中別離的代謝混合物也可以停止片面剖析，目前，已有學(xué)者將其成功地使用于擬南芥[20]和番茄[21]代謝產(chǎn)物指紋圖譜的研討中。

　　1.5數(shù)據(jù)轉(zhuǎn)換

　　爲(wèi)說明代謝物復(fù)雜的線性或非線性關(guān)系，需求停止多變量剖析，將原始的色譜圖數(shù)據(jù)轉(zhuǎn)換爲(wèi)數(shù)字化的矩陣數(shù)據(jù)，經(jīng)過對色譜峰鑒定和整合從而停止多變量剖析。由于環(huán)境等要素的攪擾，光譜數(shù)據(jù)需求經(jīng)過適當(dāng)?shù)臄?shù)據(jù)加工辦法停止校正，包括：①降低噪聲;②校正基線;③進(jìn)步分辨率;④數(shù)據(jù)規(guī)范化。Jonsson P等 [22]報(bào)道了一種關(guān)于GC?MS色譜圖數(shù)據(jù)處置的辦法，可以對少量代謝產(chǎn)物樣品停止無效的辨認(rèn)。

　　二、代謝組學(xué)中的數(shù)據(jù)剖析辦法

　　2.1主成分剖析法(PCA)

　　主成分剖析法，將實(shí)測的多個(gè)目標(biāo)用多數(shù)幾個(gè)潛在的互相獨(dú)立的主成分目標(biāo)線性組合來表示，反映原始測量目標(biāo)的次要信息。使得剖析與評價(jià)目標(biāo)變量時(shí)可以找出主導(dǎo)要素，切斷其他相關(guān)要素的攪擾，作出更爲(wèi)精確的估量與評價(jià)。PCA數(shù)據(jù)矩陣通常來自于GC?MS，LC?MS 或CE?MS，因而將目的代謝產(chǎn)物作爲(wèi)自變量，而相應(yīng)的代謝產(chǎn)物含量作爲(wèi)因變量，定義與最大特征值方向分歧的特征向量爲(wèi)第一主成分，依此類推，PCA便能經(jīng)過對幾個(gè)次要成分的剖析，從代謝組中辨認(rèn)出無效信息。主成分剖析有助于簡化剖析和多維數(shù)據(jù)的可視化，但是該辦法能夠招致一局部有用信息的喪失。

　　2.2層次聚類剖析法(HCA)

　　層次聚類剖析法也常用于代謝組學(xué)的研討中，它是將n個(gè)樣品分類，計(jì)算兩兩之間的間隔，構(gòu)成間隔矩陣，兼并間隔最近的兩類爲(wèi)一新類，計(jì)算新類與以后各類的間隔。再兼并、計(jì)算，直至只要一類爲(wèi)止。停止層次聚類前首先要計(jì)算類似度(similarity)，然后運(yùn)用最短間隔法(Nearest Neighbor)、最長間隔法(Furthest Neighbor)、類間均勻鏈鎖法(Between?groups Linkage)或類內(nèi)均勻鏈鎖法(Within?groups Linkage)四種辦法計(jì)算類與類之間的間隔。該辦法雖然準(zhǔn)確，但計(jì)算機(jī)數(shù)據(jù)密集，對少量數(shù)據(jù)點(diǎn)停止剖析時(shí)，更合適選用K?均值聚類法(KMC)或批次自組織映射圖法(BL?SOM)，而HCA合適將數(shù)據(jù)轉(zhuǎn)換爲(wèi)主成分后運(yùn)用。

　　2.3自組織映射圖法(SOM)

　　神經(jīng)網(wǎng)絡(luò)中臨近的各個(gè)神經(jīng)元經(jīng)過側(cè)向交互作用互相競爭，開展成檢測不同信號的特殊檢測器，這就是自組織特征映射的含義。其根本原理是將多維數(shù)據(jù)輸出爲(wèi)幾何學(xué)節(jié)點(diǎn)，類似的數(shù)據(jù)形式聚成節(jié)點(diǎn)，相隔較近的節(jié)點(diǎn)組成相鄰的類，從而使多維的數(shù)據(jù)形式聚成二維節(jié)點(diǎn)的自組織映射圖。除PCA和HCA外，SOM異樣也可使用于包括基因組和轉(zhuǎn)錄組等組學(xué)研討中 [23]。最后SOM計(jì)算工夫長，依托數(shù)據(jù)輸出順序決議聚類后果，近年來SOM逐步開展成爲(wèi)不受數(shù)據(jù)錄入順序影響的批次自組織映射圖法(BL?SOM)。由于BL?SOM可以對類停止調(diào)整，且有明白的分類規(guī)范，優(yōu)化次第優(yōu)于其他聚類法，已在基因組學(xué)和轉(zhuǎn)錄組學(xué)數(shù)據(jù)剖析中失掉普遍的使用。

　　2.4其他數(shù)據(jù)采礦辦法

　　除PCA、HCA和SOM外，很多變量剖析辦法都可用于動(dòng)物代謝組學(xué)的剖析。軟獨(dú)立建模分類法(SIMCA)是應(yīng)用主成分模型對未知樣品停止分類和預(yù)測，合適對少量樣本停止剖析;近鄰分類法(KNN)和K均勻值聚類剖析法(KMN)也可用于樣品分類;主成分回歸法(PCR)或偏最小二乘回歸法(PLS)在某些狀況下也可運(yùn)用。但是到目前爲(wèi)止由于還沒有樹立一個(gè)規(guī)范的數(shù)據(jù)剖析辦法，代謝組學(xué)依然是一門有待完善的學(xué)科。

　　三、代謝組學(xué)在藥用動(dòng)物中的理論

　　動(dòng)物藥材來源于藥用動(dòng)物體，而藥用動(dòng)物體的形狀建成是其體內(nèi)一系列生理、生化代謝活動(dòng)的后果。動(dòng)物代謝活動(dòng)分爲(wèi)初生代謝和次生代謝，初生代謝在動(dòng)物生命進(jìn)程中一直都在發(fā)作，其經(jīng)過光協(xié)作用、檸檬酸循環(huán)等途徑，爲(wèi)次生代謝的發(fā)作提供能量和一些小分子化合物原料。次生代謝往往發(fā)作在動(dòng)物生命進(jìn)程中的某一階段，其次要生物分解途徑有莽草酸途徑、多酮途徑和甲瓦龍酸途徑等。動(dòng)物藥材含有的生物堿、胺類、萜類、黃酮類、醌類、皂苷、強(qiáng)心苷等活性物質(zhì)的絕大少數(shù)屬于次生代謝產(chǎn)物，因而討論次生代謝產(chǎn)物在藥用動(dòng)物體內(nèi)的分解積聚機(jī)制及其影響要素，關(guān)于進(jìn)步活性物質(zhì)含量、保證藥材質(zhì)量、波動(dòng)臨床療效等具有重要意義。孫視等[24]經(jīng)過對銀杏葉中黃酮類成分積聚規(guī)律的研討，提出了選擇具有一定環(huán)境壓力的次適合生態(tài)環(huán)境處理藥用動(dòng)物栽培中生長和次消費(fèi)物積聚的矛盾。王昆等[25]以人參葉組織爲(wèi)資料,總結(jié)了構(gòu)建人參葉cDNA文庫進(jìn)程中存在的一些關(guān)鍵成績和應(yīng)采取的對策,爲(wèi)今后關(guān)于人參無效成分如人參皂苷的生物分解途徑及其調(diào)控的根底研討提供技術(shù)參考和實(shí)際指點(diǎn)。最近，美國加利福尼亞大學(xué)伯克利分校的Keasling等[26]采用一系列的轉(zhuǎn)基因調(diào)控辦法，經(jīng)過基因工程酵母分解了青蒿素的前體物質(zhì)——青蒿酸，其產(chǎn)量超越100 mg/L，爲(wèi)無效降低抗瘧藥物的本錢提供了機(jī)遇。經(jīng)過臨時(shí)的研討積聚，人們對代謝途徑的主干局部(爲(wèi)次生代謝提供底物的初生代謝途徑)曾經(jīng)根本理解，例如酚類的莽草酸途徑， 萜類的異戊二烯二磷酸(IPP)途徑等。被子動(dòng)物中一些絕對激進(jìn)的次生代謝途徑也失掉了很好的研討，如黃酮類、木質(zhì)素的生物分解與調(diào)控。但是，對次生代謝最豐厚最神奇的局部——特定產(chǎn)物分解與積聚的進(jìn)程，還所知甚少[27]。

　　四、展 望

　　近年來，代謝組學(xué)正日益成爲(wèi)研討的熱點(diǎn)，越來越多的人已參加到代謝組學(xué)的研討中。隨著代謝組學(xué)積聚的數(shù)據(jù)和信息量的增大，其在藥用動(dòng)物學(xué)各個(gè)范疇的使用價(jià)值也日積月累。它將不只能對單個(gè)代謝物停止全方面的剖析，更能尋覓其代謝進(jìn)程中的關(guān)鍵基因、經(jīng)過代謝指紋剖析對藥用動(dòng)物停止疾速分類、進(jìn)一步研討藥用動(dòng)物無效成分代謝途徑以及環(huán)境因子對動(dòng)物代謝和質(zhì)量的影響與調(diào)控機(jī)制。

　　但是根據(jù)傳統(tǒng)西醫(yī)藥學(xué)和零碎生物學(xué)的指點(diǎn)思想，目前急待處理的是中藥種質(zhì)資源的代謝組學(xué)研討和中藥體內(nèi)作用的代謝組學(xué)研討。同時(shí)，代謝組學(xué)在剖析平臺技術(shù)、辦法學(xué)手腕和使用戰(zhàn)略等方面絕對于其他組學(xué)技術(shù)還需求進(jìn)一步開展和完善，還需求其他學(xué)科的配合和介入。置信隨著更無力的成分剖析設(shè)備的運(yùn)用及代謝組數(shù)據(jù)庫的樹立，藥用動(dòng)物代謝組學(xué)將對西醫(yī)藥學(xué)發(fā)生深遠(yuǎn)的影響。

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