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HPLC法測(cè)定獨(dú)子藤中雷公藤紅素的含量
【摘要】 目的建立高效液相色譜法測(cè)定獨(dú)子藤中雷公藤紅素的含量，為雷公藤紅素的藥用植物資源開(kāi)發(fā)提供依據(jù)。方法 采用Supelco Discovery C18柱(25 cm×4.6 mm，5 μm)，流動(dòng)相為甲醇-5%(體積分?jǐn)?shù))H3PO4水溶液(體積比80∶20)，流速為1.0 mL·min-1，檢測(cè)波長(zhǎng)為426 nm。結(jié)果 雷公藤紅素在40~200 μg·mL-1范圍內(nèi)與峰面積呈良好線性關(guān)系(r=0.999 1)。獨(dú)子藤中雷公藤紅素的平均質(zhì)量分?jǐn)?shù)為0.055 5%，雷公藤紅素的平均回收率為97.6%，RSD=1.78% (n=6)。結(jié)論 該方法簡(jiǎn)便、準(zhǔn)確、靈敏度高、重現(xiàn)性好，可用于獨(dú)子藤中雷公藤紅素的含量測(cè)定;獨(dú)子藤中雷公藤紅素含量較高，可作為雷公藤紅素的資源植物加以開(kāi)發(fā)利用。
【關(guān)鍵詞】 獨(dú)子藤;雷公藤紅素;高效液相色譜法;成分分析
Abstract:ObjectiveTo determine the content of tripterine in Celastrus monospermus Roxb by HPLC for developing the medicinal resources of celastrol.Methods An external standard method by HPLC with Discovery C18 column (25 cm×4.6 mm,5 μm) was employed.The mobile phase was consisted of methanol-5%(φ) phosphoric acid solution (80︰20) (ξ)at the flow rate of 1.0 mL·min-1.The detection wavelength was 426 nm.Results It showed good linearity in the range of 40-200 μg·mL-1 (r=0.999 1).The content of tripterine in Celastrus monospermus Roxb was 0.055 5%,and the average recovery rate of celastrol was 97.6%(RSD=1.78%,n=6).Conclusion The method is simple and accurate,sensitive and reproducible and can be used in the quality control of Celastrus monospermus Roxb.The content of tripterine in Celastrus monospermus Roxb was high,which can be exploided as the herbal resource.
Key words:Celastrus monospermus Roxb; tripterine; HPLC; assay
獨(dú)子藤(Celastrus monospermus Roxb.)為衛(wèi)矛科南蛇藤屬植物，分布于我國(guó)福建、廣東、云南、貴州、廣西等省區(qū)及越南和印度等地，主要生長(zhǎng)于海拔1 000 m以上的林帶中[1]。研究表明獨(dú)子藤的化學(xué)成分主要為生物堿和木栓烷型三萜類化合物，其中木栓烷型三萜類化學(xué)成分對(duì)風(fēng)濕病、白血病和皮膚病均有較好療效[2]。雷公藤紅素為木栓烷型三萜類化合物，是雷公藤片、雷公藤多苷片等治療類風(fēng)濕病制劑的有效成分之一,主要來(lái)源于中藥雷公藤的根皮，具有抗炎、免疫抑制及抗腫瘤等多種藥理活性[3]。中美科學(xué)家于2006年聯(lián)合發(fā)現(xiàn)雷公藤紅素的抗癌新機(jī)制[4]，引發(fā)了雷公藤紅素抗癌活性研究的熱潮。我們?cè)讵?dú)子藤的化學(xué)成分研究中發(fā)現(xiàn)該植物根中富含雷公藤紅素，是一種潛在的雷公藤紅素植物資源,具有重要開(kāi)發(fā)價(jià)值。但至今尚未見(jiàn)有關(guān)獨(dú)子藤中雷公藤紅素含量測(cè)定的文獻(xiàn)報(bào)道。本文建立了獨(dú)子藤中雷公藤紅素的含量測(cè)定方法，對(duì)合理開(kāi)發(fā)獨(dú)子藤植物資源、促進(jìn)雷公藤紅素的深入研究,均具有重要意義。
1儀器與試藥
1.1儀器
Shimadzu LC-10AT型高效液相色譜儀(日本島津公司)，SPD-10AT型紫外-可見(jiàn)檢測(cè)器(日本島津公司)，HW-2000色譜工作站;Millipore溶液過(guò)濾器;Millipore 0.45 μm濾膜;AY120電子分析天平(Shimadzu公司);RE-52A旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀(上海亞榮生化儀器廠)。
1.2試藥
雷公藤紅素對(duì)照品(自制，經(jīng)HPLC法測(cè)定純度≥98%);獨(dú)子藤于2008年10月采自廣東省陽(yáng)春市，由廣東藥學(xué)院李書淵教授鑒定為獨(dú)子藤Celastrus monospermus Roxb.;硅膠(柱層析硅膠，青島海洋化工有限公司);甲醇為色譜純;水為超純水;其余試劑均為分析純。
2方法與結(jié)果
2.1色譜條件
色譜柱：Supelco Discovery C18柱(25 cm×4.6 mm，5 μm);流動(dòng)相：甲醇-體積分?jǐn)?shù)5%H3PO4水溶液(體積比80∶20);流速：1.0 mL·min-1;檢測(cè)波長(zhǎng)：426 nm;柱溫：25 ℃;進(jìn)樣量：20 μL。色譜圖見(jiàn)圖1。
2.2對(duì)照品貯備液的制備
精密稱取雷公藤紅素對(duì)照品5.0 mg，置25 mL容量瓶中，加適量甲醇溶解并定容，搖勻，得到質(zhì)量濃度為0.20 mg·mL-1的雷公藤紅素對(duì)照品貯備液。
2.3供試品溶液的制備
取獨(dú)子藤藥材適量，粉碎過(guò)40目篩，精密稱取10.0 g，裝入100 mL帶塞三角瓶中，加入三氯甲烷超聲提取3次，每次50 mL，每次30 min。靜置，濾取上清液，旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀上濃縮至干。稱取4.0 g硅膠裝柱(1.5 cm×10 cm)，以三氯甲烷1 mL超聲溶解樣品，上樣。先以三氯甲烷50 mL進(jìn)行洗脫，棄去洗脫液，再用三氯甲烷-甲醇(體積比95∶5)100 mL洗脫，收集洗脫液，回收溶劑，旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀上濃縮至干。殘?jiān)眉状既芙獠⒍ㄈ萦?0 mL容量瓶中，0?45 μm微孔濾膜濾過(guò)。平行操作5份，作為1~5號(hào)供試品溶液。[PSd041;S*2〗A.對(duì)照品; B.供試品圖1雷公藤紅素的HPLC色譜圖Figure 1HPLC chromatograms of reference
2.4線性關(guān)系的考察
分別精密吸取“2.2”項(xiàng)下對(duì)照品貯備液1、2、3、4、5 mL置于5 mL容量瓶中，分別用甲醇溶解并定容，搖勻，制得系列對(duì)照品溶液。依次取上述溶液各20 μL進(jìn)樣，依法測(cè)定。以雷公藤紅素的峰面積積分值(A)為縱坐標(biāo)，質(zhì)量濃度(ρ)為橫坐標(biāo)繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，得回歸方程為A=5.5886×103ρ-2.0127×104(r=0.999 1)。結(jié)果表明，雷公藤紅素在40~200 μg·mL-1范圍內(nèi)與峰面積呈良好線性關(guān)系。
2.5精密度試驗(yàn)
精密吸取同一雷公藤紅素對(duì)照品溶液20 μL，連續(xù)進(jìn)樣6次，測(cè)得雷公藤紅素的峰面積RSD為1?96%，結(jié)果表明儀器精密度良好。
2.6穩(wěn)定性試驗(yàn)
取同一供試品溶液，分別于0、2、4、6、8、12 h進(jìn)樣，依法測(cè)定，結(jié)果雷公藤紅素峰面積的RSD為2?98%，表明供試品溶液在12 h內(nèi)穩(wěn)定。
2.7重復(fù)性試驗(yàn)
取同一批次的獨(dú)子藤藥材，稱取5份，按“2.3”項(xiàng)下方法處理并進(jìn)樣測(cè)定，結(jié)果雷公藤紅素峰面積的RSD為2.59%，表明本方法重復(fù)性良好。
2.8加樣回收率試驗(yàn)
取獨(dú)子藤藥材6份，各5 g，精密稱定，分別按低、中、高不同質(zhì)量精密加入雷公藤紅素對(duì)照品，按“2.3”項(xiàng)下方法制備供試品溶液，依法測(cè)定，計(jì)算回收率，結(jié)果見(jiàn)表1。表1加樣回收率試驗(yàn)
2.9樣品測(cè)定
分別精密吸取“2.3”項(xiàng)下1~5號(hào)供試品溶液20 μL，注入色譜儀，依法測(cè)定。每份測(cè)3次，計(jì)算，結(jié)果其雷公藤紅素的質(zhì)量分?jǐn)?shù)分別為0.054 7%、0?056 2%、0.055 3%、0.054 0%、0.057 2%，平均值為0.055 5%，RSD為2.26%。
3討論
3.1本研究對(duì)不同樣品前處理方法效果進(jìn)行了考察，比較了三氯甲烷超聲提取后直接進(jìn)樣與三氯甲烷超聲提取后經(jīng)硅膠柱層析純化再進(jìn)樣的色譜圖。結(jié)果顯示，前者雜質(zhì)峰數(shù)目較多，對(duì)色譜柱的污染較大;而后者能有效去除其他極性雜質(zhì)，雷公藤紅素色譜峰與其他峰分離良好，測(cè)定無(wú)干擾。
3.2本研究在參照文獻(xiàn)[5-7]的基礎(chǔ)上，考察了不同流動(dòng)相的分離效果。結(jié)果表明流動(dòng)相為甲醇-體積分?jǐn)?shù)5%H3PO4水溶液(體積比80∶20)時(shí)，雷公藤紅素的峰形對(duì)稱且能與其他成分良好分離，同時(shí)亦有利于獨(dú)子藤中其他成分的含量測(cè)定。
3.3本文方法測(cè)得獨(dú)子藤中雷公藤紅素的平均質(zhì)量分?jǐn)?shù)為0.055 5%，相對(duì)較高，提示可將獨(dú)子藤作為雷公藤紅素的藥用植物資源加以開(kāi)發(fā)利用，具有重要意義。且雷公藤紅素的毒性很大，建立并完善雷公藤紅素的含量測(cè)定方法，亦有助于安全合理地利用獨(dú)子藤藥材。
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