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論視神經(jīng)離斷對神經(jīng)干細胞定向誘導分化的影響
[論文關鍵詞]干細胞；組織培養(yǎng)；視網(wǎng)膜神經(jīng)節(jié)細胞；細胞分化；
[論文摘要] 目的 探討大鼠視神經(jīng)離斷對神經(jīng)干細胞一上丘組織共培養(yǎng)誘導分化的影響。方法采用機械分離，無血清選擇培養(yǎng)的方法從孕14d的胚鼠上丘中獲取神經(jīng)干細胞并進行傳代培養(yǎng)。使用免疫熒光技術(shù)對神經(jīng)干細胞進行鑒定。采用顯微手術(shù)的方法建立大鼠視神經(jīng)離斷模型，分別取正常大鼠、假手術(shù)和視神經(jīng)離斷大鼠的上丘組織進行體外培養(yǎng)。使用組織一細胞共培養(yǎng)系統(tǒng)將大鼠上丘組織與神經(jīng)干細胞共培養(yǎng)，觀察干細胞分化過程，對分化細胞進行鑒定，并與干細胞的自然分化過程進行比較。結(jié)果從胚鼠上丘中獲得的細胞在無血清培養(yǎng)條件下聚集呈球形懸浮生長，可形成單細胞克隆，具有多向分化能力，經(jīng)免疫熒光鑒定證實為神經(jīng)干細胞。視神經(jīng)離斷大鼠的上丘組織與胚胎上丘源神經(jīng)干細胞共培養(yǎng)可以促進神經(jīng)干細胞的分化，并誘導分化出Thyl.1陽性的視網(wǎng)膜神經(jīng)節(jié)細胞。結(jié)論從胚胎大鼠上丘可以分離培養(yǎng)出神經(jīng)干細胞，與視神經(jīng)離斷大鼠的上丘組織共培養(yǎng)可以誘導上丘源神經(jīng)干細胞分化為視網(wǎng)膜神經(jīng)節(jié)細胞。
1材料與方法
1.1主要材料和試劑
孕14d和3個月齡SD大鼠均由復旦大學醫(yī)學院實驗動物中心提供。高糖DMEM／F12、Neurobasa1、N2、B27購自美國Gibeo公司；EGF、b-FGF購自美國R&D公司；小鼠抗Nestin單克隆抗體、小鼠抗Thyl.1單克隆抗體購自美國Chemieon公司；兔抗GFAP購自武漢博士德公司；兔抗MAP-2單克隆抗體購自美國Santa Cruz公司。
1.2動物分組與視神經(jīng)離斷模型
取3個月齡sD大鼠30只，雌雄不拘，隨機分為3組：正常對照組、假手術(shù)組和視神經(jīng)離斷組，每組動物均為10只。視神經(jīng)離斷組大鼠隨機選擇一側(cè)眼，在手術(shù)顯微鏡下鈍性分離顯露視神經(jīng)；在離后極約2 mm處剪斷視神經(jīng)。術(shù)后于直接檢眼鏡下觀察視網(wǎng)膜血供良好者納入試驗。假手術(shù)組動物外科操作同視神經(jīng)離斷組，但不離斷視神經(jīng)。正常對照組則不做任何處理。
1.3胚胎上丘NSCS的分離與培養(yǎng)
取孕14d的SD大鼠，孕鼠孕齡的計算方法為：將雌雄大鼠合籠后，次晨檢查發(fā)現(xiàn)陰栓者為孕0天。按照大鼠腦解剖圖譜細心分離出上丘組織。胚胎上丘NSCS的分離與原代培養(yǎng)程序參見馮東福等已建立的方法。
1.4單細胞克隆及鑒定
將第2代的神經(jīng)干細胞球，吹打成單細胞懸液。使用連續(xù)稀釋法，最終細胞密度為100／ml。參照Reynolds和Weiss的方法，建立單細胞克隆。
使用細胞免疫熒光法對傳4代的細胞克隆進行鑒定，一抗為小鼠抗Nestin單克隆抗體(1:100)，二抗為羊抗小鼠IgG Cy3(1:10)。使用TCS-SP2型激光共聚焦顯微鏡對熒光標記后的細胞克隆球進行觀察，并進行計算機三維圖像重建，激發(fā)波長為543mm。具體方法見馮東福等的報道。
1.5上丘組織培養(yǎng)
假手術(shù)組和視神經(jīng)離斷組大鼠在術(shù)后5d斷頭處死，取手術(shù)對側(cè)的上丘組織，正常對照組隨機取單側(cè)上丘組織。上丘組織培養(yǎng)采用我們已經(jīng)建立的方法。
1.6雙室組織一細胞共培養(yǎng)系統(tǒng)
該系統(tǒng)由上下兩室組成。上室為透明PET微孔(孔徑0.4μm)濾膜培養(yǎng)小室(Becton Dickinson產(chǎn)品)，下室為配套的24孔培養(yǎng)板，可將上室懸吊起來。共培養(yǎng)時將上下室組合起來。
1.7神經(jīng)干細胞的自然分化
取傳4代的NSCS懸液，從500r／min離心5min，棄上清，加入干細胞分化培養(yǎng)液(Neurobasal培養(yǎng)液+B27(1：50)+10％FBS+谷氨酰胺4 mmol／L)輕柔吹打。調(diào)整細胞密度為1×105／ml后將1 ml懸液滴入下室，上室中不放組織塊，僅加入分化培養(yǎng)液。把接種后的雙室組織一細胞共培養(yǎng)系統(tǒng)放人C02培養(yǎng)箱中于37℃ 、5％CO2條件下貼壁培養(yǎng)。隔日用相差顯微鏡觀察細胞生長分化情況，貼壁培養(yǎng)14d后進行熒光免疫細胞化學染色。1.8上丘組織一神經(jīng)干細胞共培養(yǎng)誘導分化
將傳4代的NSCS懸液以500r／min離心5min，棄上清，加入分化培養(yǎng)液輕柔吹打，調(diào)整細胞密度為1×105／ml后取1ml懸液滴入下室中于37℃ 5％C02條件下貼壁培養(yǎng)。3d后將已在體外培養(yǎng)4d的上丘組織移入共培養(yǎng)系統(tǒng)進行共培養(yǎng)。6d后將上室移去，神經(jīng)干細胞繼續(xù)培養(yǎng)至14d。
1.8分化細胞的鑒定
細胞免疫熒光染色步驟同前，根據(jù)需要上不同的一抗，抗體工作濃度分別為：MAP-2(1:50)、GFAP(1:100)、Thyl.1(1:100)。根據(jù)不同的一抗選擇FITC或Cy3熒光二抗。陰性對照使用PBS液代替一抗。對Thyl.1陽性的培養(yǎng)孔，每孔隨機選擇3個克隆，在細胞疏松區(qū)域選擇4個不同視野，記數(shù)總細胞數(shù)和Thyl.1陽性細胞數(shù)，計算陽性率。
2 結(jié)果
2.1 上丘神經(jīng)干細胞克隆形成及鑒定
大鼠胚胎上丘細胞接種48h后培養(yǎng)液明顯黃變，大部分細胞死亡，存活的部分細胞胞體增大，折光性增強，伴有明顯光暈。部分細胞出現(xiàn)分裂相，細胞可成對出現(xiàn)。隨著培養(yǎng)時間的延長，細胞團逐漸增大，呈球形懸浮生長，邊緣細胞折光性較強。對第2代細胞進行單細胞克隆培養(yǎng)后發(fā)現(xiàn)，細胞可形成亞克隆，這些來自單個細胞的亞克隆可以進行傳代培養(yǎng)，并大量增殖。
使用激光共聚焦顯微鏡，進行三維重建后可以清晰地看到克隆球呈Nestin陽性，中心的細胞較為
2.2分化細胞的鑒定
NSCS的自然分化和各共培養(yǎng)組合誘導分化分化情況。各組神經(jīng)干細胞大部分均分化為GFAP陽性的神經(jīng)膠質(zhì)細胞。少量分化為MAP-2陽性的神經(jīng)元。但只有上丘源NSCS與視神經(jīng)離斷組的上丘組織共培養(yǎng)后可見有Thyl.1陽性的視網(wǎng)膜神經(jīng)節(jié)細胞分化。在該組分化的細胞中，Thyl.1陽性細胞的比率為14.92％
2.3神經(jīng)干細胞的自然分化
神經(jīng)干細胞克隆在撤除絲裂原24h后貼壁。隨著時問延長克隆球逐漸變扁平，并以克隆為中心產(chǎn)生放射狀細胞遷移。克隆球邊緣的細胞形狀較不規(guī)則，多數(shù)細胞呈梭形或多角形，發(fā)出短而細的突起。7d后部分細胞可見長突起，細胞的折光性也各有不同。在相差顯微鏡下可見胞體較疏松，邊緣部分有散在的遷移細胞，部分細胞可見有突起發(fā)出，亦呈Nestin陽性。 大、形態(tài)不規(guī)則、具有多個粗突起的膠質(zhì)樣細胞數(shù)量較多。而胞體有很強光暈，呈圓形或橢圓形、具有1～2個細長突起的神經(jīng)元樣細胞數(shù)量較少。隨著神經(jīng)干分化時間的延長，克隆球四周的細胞逐漸增多，遷移的距離也逐漸增加。在培養(yǎng)2周時出現(xiàn)大量細胞遷移，而克隆球邊緣則逐漸模糊
2.4組織-神經(jīng)干細胞共培養(yǎng)誘導分化
上丘神經(jīng)干細胞經(jīng)與組織共培養(yǎng)24h后均貼壁生長，克隆球逐漸變扁平。部分克隆球邊緣有細胞突起發(fā)出，開始分化過程。在培養(yǎng)48h后可見細胞向外遷移，在相差顯微鏡下呈明顯的“太陽征”在培養(yǎng)5d時，以克隆為中心產(chǎn)生的
3 討論
雖然干細胞的體外誘導分化已經(jīng)有較多研究，但在體外誘導NSCS向RGCs分化，特別是采用上丘組織與NSCS共培養(yǎng)誘導分化的研究目前還未見報道。筆者采用了一種新型的雙室共培養(yǎng)誘導NSCS分化模式，細胞與組織不在一個平面上。下室為多聚賴氨酸包被的培養(yǎng)板，用于細胞培養(yǎng)。上室底部的PET膜使用細胞外基質(zhì)包被，并經(jīng)過蝕刻處理，有利于細胞的遷移，其組織貼壁率明顯優(yōu)于傳統(tǒng)培養(yǎng)載體。組織接種到小室底部PET膜上后，與下室組合在一起進行共培養(yǎng)。由于PET膜上分布的孔徑為0.4μm，所以膜上細胞分泌的分子會穿過PET膜孔到達下面，但細胞卻無法進行直連續(xù)放射狀細胞遷移，這些細胞的形態(tài)大多是圓形或梭形，多數(shù)細胞有較長突起，也有一些細胞體未見明顯突起長。在培養(yǎng)2周后，大部分克隆明顯減小，而不同克隆分化出的細胞交織成網(wǎng)，細胞間的突起相互連接。接接觸，因此可以排除細胞接觸因素的影響。
在哺乳動物中樞神經(jīng)系統(tǒng)的發(fā)育過程中，各種神經(jīng)元與對應的靶組織建立突觸聯(lián)系往往是其存活和進一步成熟分化的重要條件。大鼠出生時視覺系統(tǒng)尚未成熟，視網(wǎng)膜神經(jīng)細胞，特別是節(jié)細胞，在出生后的成熟和分化，皆有賴于其靶組織一中腦上丘提供神經(jīng)營養(yǎng)和誘向因子。因此筆者通過將NSCS與RGCS的靶組織共培養(yǎng)的方法，探討靶組織在體外環(huán)境下對NSCS分化的影響。筆者發(fā)現(xiàn)視神經(jīng)離斷成年大鼠的上丘組織均可誘導NSCS分化為RGCS，而假手術(shù)組和正常對照組的上丘組織則無此作用。
上丘對RGCS的作用是通過一系列復雜的化學因子調(diào)節(jié)的，其中較為重要的是神經(jīng)營養(yǎng)因子的作用。Frost等報道在上丘中腦源性神經(jīng)營養(yǎng)因于的表達水平與RGCS發(fā)育程度相關，出生后15d內(nèi)的倉鼠上丘B(yǎng)DNF保持在較高水平，而在成年期其含量下降約1／3左右。Kretz等則發(fā)現(xiàn)另一種神經(jīng)營養(yǎng)因子——睫狀神經(jīng)營養(yǎng)因子在發(fā)育期上丘的表達也具有同樣的時間依賴性。這些神經(jīng)營養(yǎng)因子在發(fā)育期的高表達，對于神經(jīng)干細胞的增殖、分化同樣具有重要作用。筆者從胚胎大鼠上丘組織中成功分離出具有多向分化能力的NSCS，也說明發(fā)育期的上丘組織存在NSCS存活、分化的微環(huán)境。
但對于成年動物，上丘對視網(wǎng)膜細胞的促進生長作用逐漸消失。而在視神經(jīng)離斷后，上丘可以再現(xiàn)胚胎期對視網(wǎng)膜神經(jīng)節(jié)細胞的誘向作用。在胚胎發(fā)育過程中，未成熟星形膠質(zhì)細胞表達vimentin，但隨著發(fā)育完成vimentin的表達逐漸消失。在成年動物上丘中，已無vimentin表達。但在視神經(jīng)損傷后，上丘組織中再次出現(xiàn)了vimentin陽性表達的未成熟星形膠質(zhì)細胞。視神經(jīng)損傷的發(fā)生激活了星形膠質(zhì)細胞的“再發(fā)育”，這些細胞類似于胚胎上丘細胞的vimentin陽性細胞，可以分泌視網(wǎng)膜細胞發(fā)生所需要的神經(jīng)營養(yǎng)和誘向因子。此外，視神經(jīng)損傷后的上丘組織中還出現(xiàn)了小膠質(zhì)細胞的大量增殖，這些小膠質(zhì)細胞對星形膠質(zhì)細胞各種細胞外基質(zhì)(ECM)的表達具有重要作用。ECM是由各種糖蛋白、黏蛋白、神經(jīng)黏附因子等組成，在空間上是神經(jīng)微環(huán)境的重要組成部分，可以通過調(diào)整黏附和信號分子的聚集，起到微環(huán)境信號放大器的作用。
存筆者的實驗中，正常成年大鼠上丘組織雖然也可以在體外培養(yǎng)條件下生長，但并不能誘導NSCS向視網(wǎng)膜神經(jīng)節(jié)細胞分化。而上丘源NSCS與視神經(jīng)離斷后5d的大鼠上丘組織共培養(yǎng)則可以向RGCS分化，這可能與視神經(jīng)離斷后上丘細胞發(fā)生的一系列功能的“激活”有關。由于筆者采用的共培養(yǎng)系統(tǒng)排除了細胞間直接接觸的影響，因此，視神經(jīng)離斷后上丘細胞可能通過分泌某種因子對NSCS的分化方向產(chǎn)生影響。對相關因子的進一步研究將可能有助于對視神經(jīng)損傷再生機制的了解。同時，體外誘導NSCS定向分化為RGCS的成功也為視神經(jīng)損傷修復提供了新的細胞來源。然而，這些分化而來的RGCS雖然通過細胞免疫學檢測證明。
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