山東籍漢族尋常型天皰瘡與HLA

                              作者：周淑華 王秀敏 韓兆東 高昱 張玉杰 楊 磊 張建明 王忠永

【關鍵詞】  天皰瘡；尋常型；聚合酶鏈反應；HLA
       【摘要】  目的  探討HLADRB1、DQB1位點基因在山東籍漢族尋常型天皰瘡易感性中的作用。方法  用序列特異性引物聚合酶鏈反應（PCRSSP）方法，對61例尋常型天皰瘡（pemphigus vulgaris,PV)患者和57名正常對照者進行了HLADRB1、DQB1等位基因的分型，并分析了DRB1、DQB1基因在兩組中的分布。結果  與正常對照組比較，PV患者組DRB1 *14（*1401、*1404、*1405）基因頻率明顯增高（Pc分別＜0.05)。結論  HLADRB1*14是山東籍漢族PV的易感基因。
    【關鍵詞】  天皰瘡；尋常型；聚合酶鏈反應；HLADRB1
    【Abstract】  Objective  To investigate the predisposing role of HLADRB1 genes in pemphigus vulgaris(PV).Methods  We used polymerase chain reactionspecific sequence primers method to type HLADRB1,DQB1 subregion in the patients with PV of Han nationality from Shandong Province and matched control subjects.Results  The results demonstrated that DR4,DRB1*14(*1401,*1404,*1405)gene frequencies were significantly higher in PV than those in controls(Pc＜005).Further typing of DR4 positive subjects revealed that the gene frequencies of DRB1*0406 were significantly in PV patients compared with controls(P＜005).Conclusion  The results suggested that HLADRB1*14 may be the susceptible haplotypes for PV patients in Chinese Han.
    【Key words】  pemphigus  vulgaris,PCR,HLADRB1,HLADQB1
    天皰瘡是一種原因不明的自身免疫性疾病，結合于角質形成細胞表面的自身抗體導致細胞連接松弛，結果使皮膚粘膜發(fā)生水皰或大皰［1］。國外研究提示，本病與HLAⅡ類基因相關。為探討遺傳易感性在天皰瘡發(fā)病機制中的作用，本文用序列特異性引物聚合酶鏈反應（PCRSSP）方法對山東籍漢族人尋常型天皰瘡（pemphigus vulgaris,PV）患者進行了HLADRB1基因分型，并探討HLAⅡ類在我國PV發(fā)病中的作用。
    1  對象與方法
    11  研究對象  選擇山東籍漢族PV患者，為2001年8月至2004年1月門診或住院者，共53例。根據(jù)臨床表現(xiàn)、組織病理和免疫熒光確診，并無其他免疫性疾病，其中男30例，女23例，年齡27~82歲，平均年齡（4637±1323）歲。對照組為山東地區(qū)與患者無血緣關系的健康漢族個體，共70人，年齡19~74歲，平均年齡（4911±1251）歲；其中男37人，女33人。除記錄年齡、性別、病程等一般情況外，根據(jù)以下內容對患者進行登記隨訪，①病情：根據(jù)治療前皮損情況將病情分為輕度、中度與重度。水皰、紅斑或糜爛面數(shù)目≤20塊，或皮損面積≤15%體表面積者為輕度。水皰、紅斑或糜爛面20~50塊，或皮損面積占體表面積的15%~50%者為中度。水皰、紅斑或糜爛數(shù)目≥50塊，或皮損面積≥50%體表面積，或粘膜損害明顯以及皮損面積≥40%體表面積者為重度。②有無黏膜損害。③病期：活動期，指患者不斷出現(xiàn)紅斑與張力性水皰大皰；緩解期，無明顯水皰發(fā)生，留有陳舊性皮損。④治療反應：即糖皮質激素須用量，分為用常規(guī)劑量皮質類固醇（相當于潑尼松1 mg・kg1・d1）能控制病情組，與須用大劑量皮質類固醇才能控制病情組。
    12  方法
    121  基因組DNA的制備：參考文獻［2，3］用飽和鹽洗法提取基因組DNA。
    122  DRB1、DQB1基因片段的體外擴增：參考文獻［2］設計引物，本課題所用的HLADRB1、DRB1*04和DQB1基因引物均由中國醫(yī)學科學院細胞生物研究所上海賽爾公司合成�？偡磻�體積為50 μl，其中包括：基因組DNA 60 ng，濃度為50 pmol/μl的上游引物和下游引物各25 μl，陽性對照引物用量為特異性引物的1/5，10×PCR緩沖液5 μl，25 mmol/L MgCl2 5 μl，25 mmol/L dNTP 5 μl，TaqDNA聚合酶（Promega）15 u。各等位基因引物的反應條件參考文獻［2，3］。
    123  序列分析：根據(jù)已發(fā)表的核苷酸序列對有關等位基因進行序列分析。
    124  統(tǒng)計學分析：用直接計數(shù)法計算基因頻率。兩組間基因頻率的比較采用χ2檢驗。P值均用Bonferron法進行校正得校正P值（Pc），即P值乘以實驗系統(tǒng)所檢出的基因數(shù)，顯著性檢驗水平為005。用比值比（OR）代表疾病與HLA基因的相關性強度。
    2  結果
    21  PCR擴增效果的檢測  基因組DNA樣本經(jīng)PCR擴增后，陽性者在18%的瓊脂糖電泳凝膠上可見一清晰條帶，分子量與預期值一致。
    22  HLADRB1基因分型結果  53例PV患者組和70例正常對照組的HLADRB1基因頻率見表1。表1  PV患者和對照組HLADR基因頻率的分布DR基因PV組(n=53)結果顯示，DRB1*14在PV組的基因頻率高于健康對照組（OR=567，χ2=1318，Pc=000369）：DR4在PV組的基因頻率高于健康對照組，但P值經(jīng)矯正后無統(tǒng)計學意義。
    23  相關性分析結果  DRB1*04與黏膜損害呈正相關，與所須皮質類固醇激素用量呈正相關。女性患者與DRB1*04相關性較男性患者更明顯。
   　 3  討論
　　應用血清學方法研究發(fā)現(xiàn)，中歐與東歐的猶太人（Ashkenazi 猶太人）尋常型天皰瘡與HLADR4血清型相關，非猶太人天皰瘡與HLADR4及HLADR6血清型相關［4］。不同種族間天皰瘡與HLA的相關性不同。法國人尋常型天皰瘡與HLADRB1*0402，DRB1*1401，DRB1*1404，DQB1*0302和DQB1*0503相關［5］。日本PV與HLAⅡ類抗原相關性研究中報道了PV與HLADRB1*1405以及DQB1*0503相關［6］。中國北方漢族PV中HLADRB1*12、DRB1*14較正常人頻率高，而DRB1*1501/1502和*0901頻率降低，提示上述基因分別是PV的易感基因和保護基因［7，8］。

我們使用PCRSSP方法獲得我國山東籍漢族PV患者HLADRB1基因頻率。在進行HLAⅡ類基因分型時，實驗結果準確可靠，重復性好；分型結果較血清學方法精細，對一些血清學特異性相同的，可借助PCRSSP技術分出其基因型別的差異。為了提高分型結果的精細程度，可根據(jù)需要，針對低分辨的型別，進一步設計組內各亞型特異性的引物，再進行PCRSSP［3］。我們的結果提示，與正常對照組比較，PV患者組DRB1*14（*1401、*1404、*01405）基因頻率明顯增高（Pc分別＜005），表明DRB1*14與山東漢族PV呈強相關。相關性分析結果提示，DRB1*04與黏膜損害呈正相關，與所須皮質類固醇激素用量呈正相關。作者既往對HLADQB1的研究結果表明，PV患者中DQB1*0503頻率顯著高于正常對照組。漢族人群中HLADR*14與DQB1*0503呈連鎖不平衡。在所有HLADRB1*14陽性的PV患者中，DQB1*0503的頻率與對照組間無顯著差別。結合序列分析結果，DRB1*0403、DRB1*0406、DRB1*1401、*1404、*1405抗原的β鏈高變區(qū)第26位、67位、71位、86位上的氨基酸殘基相同，它們分別是苯丙氨酸、亮氨酸、精氨酸、纈氨酸。DQB1*0503、DQB1*0302則不具備上述氨基酸殘基［9］。上述結果支持與漢族ＰＶ相關聯(lián)的主要是上述ＤＲＢ１基因。
    參  考  文  獻
    1Mentink LF,Mackenzie MW,Toth GG,et alRandomized controlled trial of adjuvant oral dexamethasone pulse therapy in pemphigus vulgaris［J］Arch Dermatol,2006，142(5):570
　 2周淑華，林麟，靳培英，等江蘇、安徽漢族天皰瘡患者HLADR基因的相關性研究［J］中華皮膚科雜志，2002，35:13
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    6Niizeki H,Inoko M,Mizuki N,et alHLADQB1 and DRB1 genotyping in Japanese pemphigus vulgaris patients by the PCRRFLP method［J］Tissue Antigens,1994，44:248
    7耿龍，翟寧，張慶瑞，等中國北方漢族尋常型天皰瘡與HLADRB1等位基因的相關性研究［J］中華醫(yī)學遺傳學雜志,2000,17：303
    8耿龍，翟寧，肖汀，等中國北方漢族尋常型天皰瘡與HLADRB1等位基因的相關性研究［J］中華皮膚科雜志，2000，33:277
    9周淑華，林麟，靳培英，等HLADRB1基因與漢族人尋常型天皰瘡的相關性研究［J］中華醫(yī)學遺傳學雜志,2003,20:79
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    13Ahmed AR,Wagner R,Khatri K,et alMajor Histocompatibility complex haplotype and class Ⅱ genes in nonJewish patients with pemphigus［J］Proc Natl Acad Sci USA,1991,88:5056
    14Niizeki H,Inoko M,Mizuki N,et alHLADQA1,DQB1 and DRB1 genotyping in Japanene pemphigus vulgaris patients by the PCRRFLP［J］Tissue Antigens,1994，44:248
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    16Zetterquist H,Olerup OIdentification of the HLADRB1*04,07 and 09 alleles by PCR amplificationwith sequencespecific primers(PCRSSP) in 2 hours［J］.Tissue Antigens,1992,34:64
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