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動物細胞培養(yǎng)工藝過程監(jiān)測與控制
在細胞培養(yǎng)的過程中，隨著細胞的增殖、底物的消耗及產(chǎn)物的生成，整個培養(yǎng)系統(tǒng)的狀態(tài)一直在產(chǎn)生變化。而各種狀態(tài)變量都有其限制范圍，當超出其界限值時就會對培養(yǎng)過程產(chǎn)生消極的影響，降低培養(yǎng)效率。例如培養(yǎng)基的PH值在培養(yǎng)全過程都應(yīng)控制在6.8-7.4的范圍內(nèi)。因此在動物細胞的培養(yǎng)工藝中，利用過程監(jiān)測與控制技術(shù)使培養(yǎng)系統(tǒng)保持在最佳的狀態(tài)也是整個工藝中重要的一環(huán)。過程監(jiān)測是指應(yīng)用各種檢測技術(shù)對培養(yǎng)過程中狀態(tài)變量的變化進行追蹤的行為。當這些變量與預(yù)測值或與預(yù)期變化方式相偏離時，通過過程監(jiān)測的手段便可以及早發(fā)現(xiàn)并開始利用已設(shè)定的模型計算如何改變培養(yǎng)狀態(tài)以及時補償這種偏離。而過程控制則利用過程監(jiān)測所提供的信息按照暨定方案進行調(diào)整，以使培養(yǎng)過程向更好的方向發(fā)展。由于生物培養(yǎng)過程中許多關(guān)鍵變量的值不能夠直接在線測得，因此過程監(jiān)測的基本任務(wù)之一就是利用直接測得的變量值去估算間接變量的值，而這也就是狀態(tài)估計的概念。1、在線測量大規(guī)模動物細胞培養(yǎng)中由于大量細胞的代謝，細胞培養(yǎng)環(huán)境迅速改變，在線過程監(jiān)控更為重要。離線取樣測定特別是產(chǎn)物濃度測定往往需要一天的時間，因此這種測定結(jié)果，不能用來及時指導(dǎo)生物反應(yīng)器有關(guān)參數(shù)的控制和細胞培養(yǎng)環(huán)境的優(yōu)化，而且頻繁取樣容易造成污染，增加費用。因此在線測定生物反應(yīng)器中培養(yǎng)條件、代謝產(chǎn)物和目的產(chǎn)物濃度等大量數(shù)據(jù)，并對測定結(jié)果進行分析處理，及時對培養(yǎng)系統(tǒng)進行反饋控制是成功進行大規(guī)模動物細胞培養(yǎng)的需要[[i]]。在培養(yǎng)過程中對于過程監(jiān)測與控制具有重要意義同時又可在線測量的參數(shù)主要包括：溫度、PH值、pO2、攪拌速率、補料速率、罐壓以及排出氣體中O2和CO2的分壓，等等。因此，在工業(yè)上應(yīng)用生物反應(yīng)器進行動物細胞培養(yǎng)時，這些參數(shù)都是被在線測量的對象。溫度與PH值這兩個參數(shù)對于細胞而言是最基本的影響因素，而在控制時往往與其它參數(shù)相獨立。溫度的測量通常在生物反應(yīng)器內(nèi)部的單一位置，采用熱敏電阻檢測器（如Pt100熱電阻）進行。PH值則多用復(fù)合式玻璃電極測量。Clark復(fù)膜氧電極則是溶解氧濃度最常用的檢測元件。所有此類檢測元件都已成為生物反應(yīng)器的標準配置。攪拌轉(zhuǎn)速的檢測一般是通過應(yīng)用磁感應(yīng)式，光感應(yīng)式或測速發(fā)電機來實現(xiàn)的。磁感應(yīng)式和光感應(yīng)式檢測器是通過計測脈沖數(shù)來測量轉(zhuǎn)速的。安裝在攪拌軸或電機軸上的切片切割磁場或光束而產(chǎn)生脈沖電訊號，則脈沖頻率就反映了攪拌轉(zhuǎn)速的大小。而測速發(fā)電機是安裝在攪拌軸或電機軸上的小型發(fā)電機，它的輸出電壓和轉(zhuǎn)速間有良好的線性關(guān)系。補料速率直接影響到培養(yǎng)基中營養(yǎng)物質(zhì)的濃度，它的值多由輸送液體所用泵的單位流量與輸送時間來計算，而泵的單位流量需在培養(yǎng)開始前用補料管道進行實際校準。如果不斷對補料瓶內(nèi)的剩余體積進行監(jiān)測，則可以得到足夠精確的補料數(shù)據(jù)來計算其他參數(shù)。對于通氣流量測定有多種不同的方法。根據(jù)作用原理，流量計可分成兩大類型：體積流量型和質(zhì)量流量型。體積流量型是根據(jù)流體動能的轉(zhuǎn)換以及流體流動類型的改變而設(shè)計的測量裝置。它會引起流體能量的不同程度的損失，而且測量值受到溫度和壓力變化的影響。其主要形式有同心孔板壓差式流量計和轉(zhuǎn)子流量計。質(zhì)量流量型是根據(jù)流體的固有性質(zhì)，如質(zhì)量、導(dǎo)電性、電磁感應(yīng)性、離子化、熱傳導(dǎo)性能等進行設(shè)計的流量計。如利用熱傳導(dǎo)性能對空氣進行測量時沒有能量損失，也不受溫度和壓力的影響。在對尾氣中O2與CO2濃度的測量上可以利用質(zhì)譜儀進行，但實際生產(chǎn)與實驗中常利用O2的順磁性和CO2的紅外吸收特性進行測定。2、狀態(tài)估計過程變量估計問題大致可以分為兩類：狀態(tài)估計和參數(shù)估計，所謂狀態(tài)變量即是指表示系統(tǒng)動態(tài)過程的性態(tài)所需的一組最少數(shù)目的變量，它是描述過程內(nèi)在本質(zhì)的，不一定是物理上可測的變量；而參數(shù)一般即指數(shù)學模型方程中待定的未知系數(shù)。狀態(tài)和參數(shù)的基本區(qū)別在于前者隨時間變化，而后者隨時間保持不變或緩慢變化。對細胞培養(yǎng)過程所處的狀態(tài)進行分析時，最直接的方法就是通過在線測量獲得數(shù)據(jù)，再將其代入已有的過程模型中，從而得到關(guān)鍵狀態(tài)變量（如細胞密度、代謝速率、產(chǎn)物濃度等）的估計值。細胞在培養(yǎng)過程中，對環(huán)境的微小變化也是極為敏感的，因此狀態(tài)估計所用的模型參數(shù)也處于不斷變化之中。故而狀態(tài)估計的問題就在于如何從一個運行中的培養(yǎng)系統(tǒng)內(nèi)不斷獲得必需狀態(tài)參數(shù)的修正值，從而利用在線測得的直接數(shù)據(jù)正確地分析培養(yǎng)過程所處的狀態(tài)。用于狀態(tài)估計的技術(shù)按照其性質(zhì)及在實踐中的應(yīng)用可分為許多類型。例如對系統(tǒng)本身及檢測數(shù)據(jù)時產(chǎn)生的隨機干擾噪聲采用的濾波技術(shù)，及針對動態(tài)系統(tǒng)特性發(fā)展出的“推廣卡爾曼濾波”技術(shù)；應(yīng)用非線性動態(tài)系統(tǒng)模型以直接檢測數(shù)據(jù)推算不能夠直接檢測變量的技術(shù)；應(yīng)用狀態(tài)觀測器以動力學模型推測不能夠直接檢測變量的技術(shù)；應(yīng)用連續(xù)參數(shù)估算器不斷調(diào)整過程模型中的參數(shù)以適應(yīng)實際觀測數(shù)據(jù)，從而對狀態(tài)作出估計的技術(shù)等。3、過程控制的基本類型控制系統(tǒng)在對培養(yǎng)參數(shù)進行調(diào)整時可以采用許多模式。總體上可分為開環(huán)（open-loop）控制系統(tǒng)與閉環(huán)（close-loop）控制系統(tǒng)。（1）開環(huán)控制系統(tǒng)若系統(tǒng)的控制器與被控對象之間只有順向作用，沒有反向作用，即系統(tǒng)的輸出量對控制作用沒有影響，則稱該系統(tǒng)為開環(huán)控制系統(tǒng)。以細胞培養(yǎng)過程為例，這種控制模式的中心思想是在維持常規(guī)參數(shù)（溫度、攪拌、DO、pH等）穩(wěn)定的同時，通過已建立的數(shù)學模型預(yù)測某一時間點細胞的生長代謝狀態(tài)，估算氨基酸代謝通路和流量以及ATP的消耗，并以此作為培養(yǎng)基補加策略及成分調(diào)整的依據(jù)，在細胞狀態(tài)發(fā)生改變之前作出調(diào)整。在這方面，關(guān)于雜交瘤生長和單抗生成的多種數(shù)學模型已經(jīng)建立[[ii],[iii]]。系統(tǒng)化、結(jié)構(gòu)化的補料策略也有了相當?shù)陌l(fā)展[[iv],[v]]。但由于這種模式要求對細胞生長和代謝的每一個細節(jié)都很清楚，在目前對生物體復(fù)雜的內(nèi)在機理認識不足的情況下，理論預(yù)測與培養(yǎng)實踐仍有很大差距，這使得理論模型應(yīng)用于實際生產(chǎn)受到了很大限制。（2）閉環(huán)控制系統(tǒng)系統(tǒng)的輸出量或狀態(tài)變量對控制作用有直接影響的系統(tǒng)稱為閉環(huán)控制系統(tǒng)。閉環(huán)模式相對于開環(huán)模式主要的區(qū)別是不需要建立模型去預(yù)測細胞和微環(huán)境將來的變化,而是通過在線(on-line)和/或離線(off-line)檢測手段獲得狀態(tài)數(shù)據(jù)，由人工或控制軟件根據(jù)當前值的變化即時調(diào)整培養(yǎng)設(shè)定參數(shù)，使培養(yǎng)系統(tǒng)始終處于最佳狀態(tài)。這種模式是在細胞狀態(tài)發(fā)生改變之后作出調(diào)整，也稱為反饋控制模式。細胞培養(yǎng)過程中溫度、PH及溶解氧濃度等基本變量的控制都是采用閉環(huán)模式進行的。同時由于控制的目的是減小實測值與設(shè)定值間的差距，因此屬于負反饋控制。針對動物細胞培養(yǎng)，當前研究的方向有：利用攝氧速率（OUR）與底物消耗速率、副產(chǎn)物生成速率等參數(shù)綜合估算的結(jié)果來反饋調(diào)整營養(yǎng)物的流加及培養(yǎng)基的灌流[[vi],[vii],[viii],[ix],[x]]；利用葡萄糖、谷氨酰胺等物質(zhì)的消耗速率及預(yù)先設(shè)定的濃度變化點來反饋調(diào)整營養(yǎng)物流加速率[[xi]]；利用培養(yǎng)過程中各種相關(guān)物質(zhì)濃度間的比值設(shè)計出“軟探針”，并以此反饋控制培養(yǎng)過程[[xii]]。（3）PID(proportional integral derivative)控制模型在培養(yǎng)實踐中，一些狀態(tài)變量如溫度，只需要控制在37℃或其他固定的點上就可以滿足要求，則其控制采用“三點控制模式”即可。具體控制過程是首先以設(shè)定點為基準設(shè)置上、下限，當溫度高于/低于設(shè)定上限時啟動/關(guān)閉冷卻系統(tǒng)，當溫度低于/高于設(shè)定下限時啟動/關(guān)閉加熱系統(tǒng)，如此使溫度保持恒定。但在對更多的狀態(tài)變量（如PH，補料速率）進行閉環(huán)控制時采用這種簡單的方法會導(dǎo)致狀態(tài)變量不斷地圍繞設(shè)定值波動，對細胞的生長與代謝產(chǎn)生不良影響。在利用閉環(huán)模式對培養(yǎng)系統(tǒng)進行控制時，為有效而穩(wěn)定地減小實測值與設(shè)定值間的偏差而免去人為的干預(yù)，自動控制理論中一種狀態(tài)校正模式—PID(proportional integral derivative)控制模式便得到了廣泛的應(yīng)用。它的微分方程表達式為式中u(t)為輸出值或設(shè)定值，e(t)為輸入值或?qū)崪y值與設(shè)定值間的偏差，而式中的設(shè)計參數(shù)分別為比例增益KP、積分增益KI和微分增益KD。利用這種控制模式可以使系統(tǒng)在受干擾而發(fā)生波動時盡快進入穩(wěn)定狀態(tài)，使細胞所受影響減到最低。具體的控制過程如圖所示，狀態(tài)變量在PID模式控制下隨時間進行而趨于穩(wěn)定：
| 設(shè)定值 |
[i]林福玉，陳紹烈，劉紅，等.大規(guī)模動物細胞培養(yǎng)的問題及對策.生物技術(shù)通報，1999，7(1):32-35[ii] Nielsen L.K.,et al.Avoiding rapid growth at high cell densities:a potentially important optimisation criterion for hybridoma cultures.Cytotechnology,1992,9:21-34.[iii]胡顯文，李佐虎，陳建新，等.氣液雙升式反應(yīng)器動物細胞培養(yǎng)及批式生長動力學模型.生物技術(shù)通訊，1999,10(2):104-108.[iv] C.S. Sanderson,et al.A structured, dynamic model for animal cell culture systems. Biochemical Engineering Journal,1999,3:203-211.[v] Christoph Herwig,et al.On-line stoichiometry and identification of metabolic state under dynamic process conditions.Biotech
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