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青枯菌病害的研究進(jìn)展
摘要：細(xì)菌性青枯病危害多種作物,抗病育種是病害防治最為可行的途徑,ＤＮＡ分子標(biāo)記是深化作物青枯病抗性遺傳改良的重要方面。生防研究近幾年也取得了較大的進(jìn)展，本文著重從這兩個方面對青枯病的研究做一綜述。關(guān)鍵詞：青枯菌 生化變種 致病機理 分子標(biāo)記
青枯病是一種由青枯菌(Ralstonia dolaanacearum)引起的毀滅性土傳病害，發(fā)病植物莖葉萎蔫下垂直至全部枯死，是世界上危害最大、分布最廣、造成損失最嚴(yán)重的植物病害之一，至今尚沒有有效的化學(xué)農(nóng)藥和其他防治辦法。因此青枯病被稱為植物的“癌癥”。植物青枯菌R.. dolaanacearum可侵染40多個科200多種植物, 僅次于農(nóng)桿菌(Agrobacterium tu me faciens)。是番茄、馬鈴薯、花生、甘薯、煙草、辣椒、茄子、生姜、草莓、香蕉以及一些貴重藥材和花卉植物許多植物生產(chǎn)的重要限制因素,世界各地均有分布。青枯病菌是一個復(fù)雜的群體，有明顯的生理分化，不同地區(qū)和不同寄主來源的菌株，在寄主范圍、致病力、生化型、血清型等細(xì)菌學(xué)特性上差異很大，因此增加了對此病害防治研究的難度。近幾年來許多科研工作者從不同的角度不同對青枯菌進(jìn)行了多方面的研究。
1 青枯菌菌系的組成
青枯菌生理生化復(fù)雜，各國的家都對其進(jìn)行了種以下的分類或分型的各種嘗試。有兩個亞分類系統(tǒng)已被國際所公認(rèn)。一是按不同來源菌株對不同植物種類的致病性差異，將青枯菌劃分為不同的生理小種（Race）。60年代已命名4個小種：小種1號（可侵染茄科植物和其他科植物），小種2號（只侵染香蕉、大蕉和Heliconia），小種3號（只侵染馬鈴薯，偶爾侵染番茄和茄子），小種4號（只對姜致病力很強）。另一個亞分類系統(tǒng)是根據(jù)不同菌株對三種雙糖（麥芽糖、乳糖、和纖維二糖）和三種乙醇（甘露醇、山梨醇和衛(wèi)矛醇）氧化產(chǎn)酸能力的差異將青枯菌化分為4個生化變種：生化變種1（不能氧化3種雙糖和3種乙醇），生化變種2（只能氧化3種雙糖，不能氧化3種乙醇），生化變種3（能氧化3種雙糖和3三種乙醇），生化變種4（只能氧化3種乙醇，不能氧化3種雙糖）。生理小種和生化變種的關(guān)系是這樣的：生理小種1號中包含生化變種1、3和4。生理小種2號中包含生化變種1和3。生理小種3號中包含生化變種2。生理小種4號中包含生化變種4。但是，從桑樹分離的一些菌株與以往確定菌系種力不同，其對幾種代表行茄科植物的致病力很弱或不致病，而且它們具有氧化3種雙糖和甘露醇的能力，因而鑒定為一種新菌系，命名為小種5號和生化變種5號。[1] 國內(nèi)現(xiàn)在只發(fā)現(xiàn)小種1號和小種3號。小種1號是我國長江流域及其以南地區(qū)的優(yōu)勢菌系，小種3號是危害我國馬鈴薯的優(yōu)勢菌系，對我國的馬鈴薯生產(chǎn)產(chǎn)生重大的威脅。對大量青枯菌的檢測結(jié)果表明，青枯菌存在菌細(xì)單抗特異性，但還不能根據(jù)這種單抗特異性對青枯菌菌系間進(jìn)行實質(zhì)性的親緣關(guān)系的亞分類和分群模式。[2]
2 青枯菌的致病機理
研究證明，青枯菌通�？蓮闹参锔炕蚯o部的傷口侵入，引起發(fā)病。但在天然條件下，也能從沒有受傷的次生根的根冠部位侵入。植物生長時在次生根的根冠和主根的表皮間形成鞘，青枯菌能穿過這層鞘，侵入皮層細(xì)胞間隙生長，破壞細(xì)胞間中膠層，使細(xì)胞壁分離，變形，形成空腔，繼而侵染，木質(zhì)部薄壁組織使導(dǎo)管附近的小細(xì)胞受刺激形成侵填體，并移入侵填體，侵填體破裂后繼被釋放進(jìn)入導(dǎo)管，并在導(dǎo)管內(nèi)大量繁殖和快速傳播擴張，從而引起植株萎蔫死亡。植物病害生理研究證明：青枯菌在導(dǎo)管中生長時可產(chǎn)生大量的胞外多糖，其和阻礙植物體內(nèi)的水分運輸特別是容易對葉柄結(jié)和小葉處較小孔徑導(dǎo)管穿孔板造成堵塞。因而引起植株枯萎;同時，青枯菌還可以分泌于細(xì)胞外多種細(xì)胞壁降解酶（如果膠酶類和纖維素酶類）其可能也在破壞導(dǎo)管組織。青枯菌在人工培養(yǎng)時還能分泌一些生長調(diào)節(jié)物質(zhì)如IAA，CTK和Eth等但現(xiàn)有資料表明它們在植物體內(nèi)的產(chǎn)量有限。對植物死亡方面的作用尚不清楚，而且研究也少。國外的研究大量集中在胞外多糖，果糖酶和纖維素酶在致病過程中的作用。美國威斯康星大學(xué)Sequeira實驗室（1991） 報道克隆出了控制胞外多糖和脂多糖的基因簇eps A-D或ops-A-D。佐治亞大學(xué)Denny實驗室克隆出了控制胞外多糖等表型轉(zhuǎn)變的基因phc A。后證明是復(fù)合調(diào)節(jié)（Complex regulatory networks,CRN）控制胞外多糖的產(chǎn)量，控制對某些環(huán)境或信號的反應(yīng)還可控制其他致病因素。黃勇和Sequeira報道了從青枯菌株K 60(小種1號,生化變種1)分離到hrp基因簇，目前，還未能從寄主植物上找到跟hrp相對應(yīng)的抗病基因。[3]馬慶生等克隆出了青枯菌對花生的�；曰�。[4]最近又有報道已經(jīng)克隆出了青枯菌的抗病基因。
3 青枯病抗性的分子標(biāo)記
3．1茄科蔬菜的青枯病抗性
茄科植物受青枯病危害最重,涉及的作物種類最多,從世界范圍內(nèi)的寄主植物看,有關(guān)青枯病工作開展最多的也是茄科植物,尤其以番茄和馬鈴薯青枯病的研究最為普遍,其次為煙草。但是茄科蔬菜類及馬鈴薯作物等發(fā)現(xiàn)的青枯病抗性種質(zhì)較少而且抗性水平不高,抗性表現(xiàn)受環(huán)境較大,抗病品種選育受到限制,是國內(nèi)外面對的一大難題。在番茄中至今沒有發(fā)現(xiàn)顯性寡基因控制的青枯病抗性,已有抗性種質(zhì)的抗性多表現(xiàn)為數(shù)量遺傳特性,抗性位點多造成了抗性遺傳的復(fù)雜性。[5]
3.1.1番茄的青枯病抗性分子標(biāo)記
目前關(guān)于植物青枯病抗性分子標(biāo)記的報道主要是對番茄的研究。盡管番茄栽培品種之間的DNA多態(tài)性不高,但番茄具備良好的遺傳系統(tǒng),易于操作[6]。在番茄的青枯病抗性研究中,既發(fā)現(xiàn)了廣譜性位點,也發(fā)現(xiàn)了對某些菌系具有�；缘目剐晕稽c。 Danesh等研究認(rèn)為在番茄第6、7、10染色體上存在與青枯病抗性相關(guān)的數(shù)量性狀位點[7]。亞洲蔬菜研究與中心(AVRDC)Wang等研究證實了Hawaii7996(番茄中廣泛的抗源)在第6條染色體上的抗性標(biāo)記,并發(fā)現(xiàn)在第3和第8條染色體上存在抗性位點,還發(fā)現(xiàn)了一個未定位的RAPD標(biāo)記Ｋ4ａ[8]。Yui等研究獲得了Hawaii7996青枯病抗性的4個RAPD標(biāo)記,在99個Ｆ2植株中鑒定出32株具有全部4個RAPD標(biāo)記,其中2個標(biāo)記(RA12-12450和RA12-291600)被認(rèn)為與抗性主效基因連鎖[9]。Mangin等研究認(rèn)為在番茄第6條染色體上至少有2個獨立的位點與青枯病抗性有關(guān)[10]。
3.2 花生青枯病抗性種質(zhì)研究
花生在青枯菌寄主植物的抗性遺傳多樣性中有特殊地位。到2000年,世界范圍內(nèi)鑒定出高抗青枯病的花生地方品種超過120個,二倍體野生花生中也發(fā)現(xiàn)了20多份抗青枯病材料,這是其它茄科植物不可比擬的,就數(shù)量而言,花生屬植物抗性種質(zhì)的遺傳豐富性居青枯菌寄主植物首位。自20世紀(jì)初印度尼西亞首次發(fā)現(xiàn)抗青枯病花生種質(zhì)以來,歷經(jīng)近100年,這些最早發(fā)現(xiàn)的抗病材料仍然具有很高的抗性(群體存活率)。與茄科作物相比,花生的青枯病抗性水平不僅更高,而且穩(wěn)定性更強[11]。
3.2.1 花生青枯病抗性遺傳及DNA標(biāo)
3.2.2 記研究
據(jù)現(xiàn)有研究結(jié)果,花生青枯病抗性在遺傳上受寡基因控制,如珍珠豆型花生的抗性受2對主效基因控制。育種實踐表明,花生青枯病抗性容易在品種間轉(zhuǎn)移,也易于從二倍體野生種轉(zhuǎn)移到四倍體栽培種中,如河南省農(nóng)科院和農(nóng)科院油料所均從二倍體野生花生轉(zhuǎn)移獲得了抗青枯病品系。廖伯壽等研究證明花生對青枯菌潛伏侵染反應(yīng)特性存在遺傳分化[11,12]。從2000年起,中國與國際半干旱研究所合作開展了花生青枯病抗性的分子標(biāo)記及輔助選擇技術(shù)研究,發(fā)現(xiàn)了不同花生抗病基因型間的AFLP和SSR多態(tài)性,建立了青枯病抗性的重組近交系(RI)群體,將用于繪制遺傳連鎖圖譜和基因定位�；ㄉ嗫莶】剐赃z傳基礎(chǔ)較為簡單,為分子標(biāo)記的建立乃至基因的克隆提供了可行性。
3.2.3 花生青枯病抗性的利用潛力
由于花生在對青枯病的抗性水平、穩(wěn)定性和抗性遺傳基礎(chǔ)上的特殊性,研究和分離抗性基因?qū)τ谄渌魑锴嗫莶】剐愿牧季哂兄匾臐撛谧饔?1997年在法國召開的第二屆國際植物青枯病大會(IBWS)對此提出了倡議。通過研究建立花生青枯病抗性的分子標(biāo)記,可以明確抗性基因位點,估計抗性基因作用、遺傳特性及環(huán)境影響,最終克隆和分離抗性基因,對于深化花生乃至其它作物的青枯病抗性育種具有重要的和實用意義。國際花生青枯病工作網(wǎng)(GBWWG)正利用多邊合作關(guān)系開展工作,以期在花生和其它植物青枯病抗性改良上取得突破。
4 青枯菌生防菌的研究
4．1青枯生防菌Bacillus sp
青枯生防菌 Bacillus sp。B130菌株是姜瘟靈的主要有效成分，它對包括青枯菌在內(nèi)的多種植物病原真菌和細(xì)菌有明顯的拮抗作用．B130能在PH5～8之間較快地生長，以 PH 6時菌體生長狀況為最佳，抑菌活性亦最強．培養(yǎng)初期抑菌活性隨培養(yǎng)時間而增長，但 36 h后呈下降趨勢。對蛋白粗提液等的研究表明，B130的抑菌物質(zhì)成分復(fù)雜，但主要活性部分是蛋白和多肽類物質(zhì)．[13]
4．2青枯病生防菌ANTI－8098A
福建農(nóng)科院員劉波博士主持的《農(nóng)作物青枯病生防菌ANTI－8098A的研究與》項目經(jīng)過8年努力，篩選獲得了具有自主知識產(chǎn)權(quán)的植物青枯病生防菌株ANTI－8098A，經(jīng)德國菌種保存中心鑒定為蠟狀芽孢桿菌。在完成菌株的生物學(xué)特性研究的基礎(chǔ)上，項目組自行設(shè)計并完成了生防菌劑中試規(guī)模的監(jiān)控生物反應(yīng)系統(tǒng)，建立了菌劑生物測定的標(biāo)準(zhǔn)化，成功研制出生防菌的存活基質(zhì)、菌劑生產(chǎn)工藝和保質(zhì)技術(shù)，解決了菌劑田間定殖難題。經(jīng)測定，ANTI－8098A青枯病生防菌劑幾年來在福建不同地區(qū)的茄科作物上推廣面積達(dá)5.6萬畝次，對番茄、茄子、辣椒、花生、煙草、生姜等作物青枯病田間防效高達(dá)75％－85％，與普通化學(xué)農(nóng)藥相比，價格低，效果好，不造成藥害，不污染環(huán)境，農(nóng)藥殘留不超標(biāo)，、生態(tài)和效益良好。專家認(rèn)為，這項研究首次發(fā)現(xiàn)了ANTI－8098A對青枯菌的致弱現(xiàn)象，即將青枯雷爾氏菌強致病力菌株轉(zhuǎn)化為無致病力菌株，從而抑制病害。項目組對致弱機理進(jìn)行了探索性研究，建立了PCR電泳、紫外分光、液相色譜、異源吸附蛋白、TTC培養(yǎng)基測定、寄主植物回接等致弱作用的檢測方法，為植物青枯病生物防治機理研究提供了新思路。[14]
4．3 eep( export of extracellular proteins)突變體
4．3 .1 eep缺失突變體的致病力
通過Tn5誘變技術(shù)，分離了植物青枯病菌生理小種1號、3號的胞外蛋白輸出功能喪失突變體。由于Tn5在其基因組單一的eep位點的插入，突變體失去了向培養(yǎng)液分泌產(chǎn)生胞外酶和胞外蛋白質(zhì)的能力。用堿性磷酸酯酶基因PhoA作為報導(dǎo)基因，研究這些胞外蛋白穿越突變體細(xì)胞內(nèi)膜，結(jié)果表明，[16]這些胞外蛋白質(zhì)可以穿過其內(nèi)膜，但失去了穿越其外膜的能力。胞外多糖在植物體內(nèi)和體外的產(chǎn)生沒有受到eep基因位點突變的。該突變體失去了對番茄植株的致萎能力。
4．3 .2 eep突變體防治番茄青枯病的研究
室溫內(nèi)，采用土壤接種的方法將野生型青枯菌AW和PO41接種于競爭其滅菌的土壤內(nèi)（AW 、PO41 菌懸液3 ×108細(xì)菌/ml）。同時采用浸苗法，分別把突變株AD4、AP7和熒光假單胞菌菌株JF1接種番茄幼苗。結(jié)果表明在接種初期，菌株AD4、AP7和JF1都有防治番茄青枯病的能力，但在接種20天后，只有eep突變體AD4具有生防效果。[15]
不同菌株室溫內(nèi)防治番茄青枯病結(jié)果（病株率%）
菌株 移栽后天數(shù)
5 10 15 20 30
AD4 AP7 JF1 CK 0 0 0 30 15 30 20 75 20 65 80 100 20 35 70 80 100 100 100 100
在田間，AD4對番茄青枯病的防治效果不如室溫明顯，但在接種后的1個月內(nèi)仍有一定的防治效果，隨著時間的延長，效果下降。AD4同以往各類青枯菌的不同點，在于它在失去對寄主的致病力后仍具有較好的寄主親和力。這為生物防治提供了很好的微生物資源。
5 展望
相對于其它許多植物病害而言,植物青枯病抗性的DNA分子標(biāo)記研究較少,除番茄之外,其它作物處于起步階段。由于眾多茄科作物中發(fā)現(xiàn)的高抗種質(zhì)很少,發(fā)掘新的基因和實現(xiàn)不同抗性位點的聚合是提高抗性水平的重要方面�；ㄉ骨嗫莶≠Y源豐富,抗性的遺傳行為較為簡單,抗性ＤＮＡ分子標(biāo)記的建立必將推動花生及其它作物抗性育種的進(jìn)步。我國具有微生物的資源優(yōu)勢，利用細(xì)菌病毒防治植物青枯病害有著美好的前景，隨著生物技術(shù)的進(jìn)一步應(yīng)用，一批利用遺傳工程改造的高效生防菌逐一問世，這將大大推動對植物青枯病害的研究
不久的將來，植物青枯病將不再是植物生長的“克星”。
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[1] 何禮遠(yuǎn).青枯假單胞菌在的多樣性, 植物病蟲害進(jìn)展,74-86.
[2] 何禮遠(yuǎn),康耀衛(wèi). 植物青枯菌致病機理, 植物病蟲害研究進(jìn)展,3-12.
[3] Huang Y,Xu P,Seqyeira L.In: pseudomona solanacearum.Mol Plant-microbe Interact, 1990, 3:48-53.
[4] Ma Q S,Chang M F,Tang J L etal.Mol Plant-Microbe,1988,4；169-174。
[5] 廖伯壽,許澤永,姜慧芳.植物細(xì)菌性青枯病抗性的分子標(biāo)記研究與育種潛力, 中國油料作物學(xué)報,2001,21(3)66-68.
[6] Mc Garvey JA,DennyTP,Schell MA,Spatial-temporal and quantitative analysis of growth and EPS I production by Ralstonia solanacearum in resistant and susccptiblc tomato cultivars [J], Phytopathology, 1999, 89(12): 1233-1239.
[7] Danesh D,Young ND,Partial resistance loci for tomato bacterial wilt show differential race specificity [J],Tmato Genetics Cooperative Rcport,44:12-13.
[8] Wang JF,Thoquet J ,Olovier J ,etal,Genetic nanlysis of quantitative resistance loci(QRL)of tomato varicty Hawaii7996 in Taiwan[J]Bacterial wilt disease:Molecular and Ecological Aspects, 1998.246—249.
[9] Yui M,Hirai M ,Nishimura S,etal.Random amplified poly morphic DNA(RAPD) markers forthe selection of tomatoes resistant to bacterial wilt[J].Bulletin the National Research Institute of Vegetables, Ornamental Plants and Tea,1999,14:189—198.
[10] Mangin B,Thoquet P, Oliver J,etal.Temporal and multiple quantitative trait loci analysis ofresistance to bacterial wilt in tomato permit the resolution of linked loci[J]. Genetics, 1999, 151(3):1165—1172.
[11] Liao Boshou,Host-plant resistance to groundnut bacterial wilt: genetic diversity and enhancement [A], ICRISAT,Groundnut Bacterial Wilt in Asial[C],India:icrisat,1994,91-96.
[12] Liao Boshou,Germplasm screening and breeding for resistaqnce to bacterial wilt in China [A],ICRISAT.Groundnut Bacterial Wilt in Asia[C],India: ICRISAT, 1998.75—81.
[13] 郭堅華,潘登明,任欣正. 抗青枯生防菌拮抗物性質(zhì)的初步研究, 南京農(nóng)業(yè)大學(xué)學(xué)報1994，18（2）：59～62
[14] 巫奕龍 中國和科研機網(wǎng).
[15]康耀衛(wèi),毛國璋,呂常勝等. 利用青枯菌胞外蛋白輸出缺失突變體防治番茄青枯病的研究,植物病蟲害研究進(jìn)展,314-316.
[16]康耀衛(wèi),黃建中,毛國璋等.青枯假單胞菌胞外蛋白缺失突變株的致病力, 植物病蟲害研究進(jìn)展,71.
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