1.4.2  分組與藥物血清添加

    分為正常血清對(duì)照組，肺康飲低劑量（5%）血清組、肺康飲中劑量（10%）血清組、肺康飲高劑量（15%）血清組。參照文獻(xiàn)方法［2］制備藥物血清溫育液：①藥物血清組：臨用前將用藥組大鼠血清加入RPMI1640培養(yǎng)液，濃度分別為5%、10%、15%。②對(duì)照組：對(duì)照組大鼠血清加入RPMI1640培養(yǎng)液，濃度10%。

    1.4.3  細(xì)胞培養(yǎng)

    將NC-H446細(xì)胞株常規(guī)培養(yǎng)于含10%熱滅活小牛血清的RPMI1640培養(yǎng)液（含青鏈霉素各100IU/mL）中，于37℃、5% CO2培養(yǎng)箱內(nèi)連續(xù)培養(yǎng)。

    1.4.4  肺康飲含藥血清對(duì)NC-H446細(xì)胞增殖的影響

    取對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的NC-H446細(xì)胞株以1.50×106個(gè)/mL的細(xì)胞濃度接種于96孔培養(yǎng)板內(nèi)，每孔體積200μL,在37℃、5% CO2培養(yǎng)箱內(nèi)培養(yǎng)24h換液。采用直接加入法，分別加入不同濃度（5%、10% 、15%）的含藥血清和對(duì)照血清。每組設(shè)4個(gè)復(fù)孔。繼續(xù)培養(yǎng)24h、48h后，培養(yǎng)板每孔加入50μL MTT（2mg/mL），同樣條件繼續(xù)孵育4h，吸棄上清，每孔加入100μL2甲基啞砜（DMSO）振蕩混勻，于酶標(biāo)492nm測(cè)定各孔的吸光度OD值，計(jì)算相應(yīng)的細(xì)胞抑制率：

    抑制率（%）=（1- OD實(shí)驗(yàn)組/ OD對(duì)照組）×100%

    1.4.5  肺康飲含藥血清誘導(dǎo)肺癌細(xì)胞凋亡表達(dá)的測(cè)定

    將傳代的NC-H446細(xì)胞接種于100mL培養(yǎng)瓶中，以含10%熱滅活小牛血清的RPMI1640培養(yǎng)液置37℃、5%CO2孵育箱中培養(yǎng)；培養(yǎng)24h至對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期，棄培養(yǎng)液，分別加入含有不同濃度（5%、10%、15%）的含藥血清及對(duì)照組血清的培養(yǎng)液各4mL，置培養(yǎng)箱中培養(yǎng)48h。收集48h含藥血清培養(yǎng)的NC-H446細(xì)胞培養(yǎng)液，胰酶消化，PBS洗滌3次，置入10mL離心管中離心，4℃、1000rmp、10min，棄上清；加入70%乙醇4℃固定24h以上；上機(jī)前離心去除乙醇固定液，PBS清洗2次，加入100μL含鈣PBS靜置10min，加5μL Annexin V，10μL PI，避光反應(yīng)15min，上機(jī)檢測(cè)，以不含藥血清處理的NC-H446細(xì)胞為陰性對(duì)照，計(jì)算相應(yīng)陽(yáng)性細(xì)胞表達(dá)率。

    1.5  統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

    采用多因素方差分析法檢測(cè)組間差異的顯著性。所有統(tǒng)計(jì)學(xué)檢驗(yàn)均應(yīng)用SPSS11.5統(tǒng)計(jì)軟件進(jìn)行。

    2  結(jié)果

    2.1  肺康飲含藥血清對(duì)NC-H446細(xì)胞增殖的影響

    不同濃度的含藥血清分別作用于NC-H446細(xì)胞株，分別于24h、48h采用MTT法檢測(cè)各組血清對(duì)NC-H446細(xì)胞株增殖的抑制率。結(jié)果表明，各含藥血清組對(duì)NC-H446細(xì)胞的增殖均有抑制作用，抑制作用呈1定的量效和時(shí)效關(guān)系，即隨著含藥血清濃度的增加，抑制率逐漸增加；同時(shí)隨著作用時(shí)間的延長(zhǎng)，抑制率相應(yīng)增加，見表1。表1  肺康飲含藥血清對(duì)NC-H446細(xì)胞增殖的影響（略 ）注：與同1時(shí)點(diǎn)對(duì)照血清組比較△ P<0.05,△△ P<0.01；與同組24h比較▲P<0.05

    2.2  肺康飲含藥血清對(duì)NC-H446細(xì)胞凋亡的影響

    不同濃度的含藥血清分別作用于NC-H446細(xì)胞株，分別于24h、48h，應(yīng)用流式細(xì)胞儀檢測(cè)各組細(xì)胞凋亡率。結(jié)果顯示：各含藥血清組均可誘導(dǎo)NC-H446細(xì)胞發(fā)生凋亡，與對(duì)照組間差異有顯著性，且誘導(dǎo)凋亡的作用具有1定的量效和時(shí)效關(guān)系，即隨著含藥血清濃度的增加，凋亡指數(shù)逐漸增加；同時(shí)隨著作用時(shí)間的延長(zhǎng)，凋亡指數(shù)也相應(yīng)增加，見表2。表2  肺康飲含藥血清培養(yǎng)24、48h后的細(xì)胞凋亡率（略 ） 注：與同1時(shí)點(diǎn)對(duì)照血清組比較△P<0.05,△△P<0.01；與同組24h比較▲P<0.05

    3  討論

    細(xì)胞凋亡是指在正常生理情況下，為了整個(gè)生物體的更大利益，受傷或衰老的細(xì)胞通過1種程序性細(xì)胞死亡方式犧牲自己的過程。凋亡作為細(xì)胞死亡的1種重要形式，對(duì)維持機(jī)體正常發(fā)展和保證體內(nèi)平衡有著重要調(diào)節(jié)作用。細(xì)胞凋亡紊亂、細(xì)胞周期異常導(dǎo)致腫瘤無限制增殖是腫瘤發(fā)生的重要原因之1［3］。

    研究表明，目前許多抗藥物的抗腫瘤作用可能是通過誘導(dǎo)腫瘤細(xì)胞凋亡實(shí)現(xiàn)的［4］。藥物對(duì)腫瘤治療的1個(gè)重要途徑就是誘導(dǎo)腫瘤細(xì)胞凋亡，傳統(tǒng)的益氣法和活血法在腫瘤的免疫治療中體現(xiàn)出較好療效［5］。肺康飲就是我們根據(jù)扶正祛邪的治療原則，在多年臨床實(shí)踐基礎(chǔ)上，采用益氣養(yǎng)陰、清熱解毒法研制而成的。經(jīng)臨床觀察應(yīng)用，對(duì)于中晚期非小細(xì)胞肺癌患者有1定療效，可降低化療對(duì)患者免疫功能的影響，改善患者的生活質(zhì)量［2］。

    在我們開展的實(shí)驗(yàn)中，采用含藥血清培養(yǎng)腫瘤細(xì)胞，以人非小細(xì)胞肺癌NC-H446細(xì)胞為研究對(duì)象，以促進(jìn)肺癌細(xì)胞凋亡為作用靶點(diǎn)，應(yīng)用MTT法和流式細(xì)胞儀觀察肺康飲對(duì)NC-H446細(xì)胞的作用。發(fā)現(xiàn)肺康飲含藥血清能夠抑制肺癌細(xì)胞的增殖，MTT法顯示肺康飲含藥血清對(duì)腫瘤細(xì)胞的抑制作用呈時(shí)間和劑量依賴關(guān)系，即隨著含藥血清濃度的增加，抑制率逐漸增加；同時(shí)隨著作用時(shí)間的延長(zhǎng)，抑制率相應(yīng)增加。流式細(xì)胞儀檢測(cè)發(fā)現(xiàn)肺康飲含藥血清具有誘導(dǎo)NC-H446細(xì)胞株凋亡的作用，并隨著藥物劑量的增大和作用時(shí)間的延長(zhǎng)，其作用愈明顯。由此可見肺康飲含藥血清可能是通過誘導(dǎo)腫瘤細(xì)胞凋亡而達(dá)到抑制其增殖的目的。但該方劑是否會(huì)影響細(xì)胞其它方面的改變，究竟是復(fù)方在起作用，還是其中的某種有效成分，尚有待于進(jìn)1步研究。

【參考文獻(xiàn)】
  1 Suh YA,Lee HY,Virmani A,et al.Loss of retinoic acid receptor Bete gene expression is linked to aberrant histone H3 acetylation in lung cancer cell linesd［J］.Cacer Res,2002,62(14):3945-3949

2 趙建清，李旺，張淑萍，等.肺康飲聯(lián)合化療治療晚期非小細(xì)胞肺癌臨床療效觀察［J］.中藥藥理與臨床，2006，22（5）：27

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